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DHPLC技术介绍
变性高效液相色谱(DHPLC)技术是一种能用于快速，自动和高通量检测基因的技术平台。在分子生物学研究和临床基因诊断领域中，DHPLC技术可应用于DNA的绝大部分检测，在很多领域已建立了快速、自动化核酸分析新方法和新标准。利用该技术可以对单链和双链核酸进行快速、准确、自动化的分离、分析和定量；可用于单碱基替换（或单核苷酸多态性），小片段缺失或插入等多种已知和未知基因突变的检测；DNA/RNA片段大小判定；寡核苷酸分析及纯化；基因表达定量（Q-RT-PCR）和基因型分析（Genotyping）；基因表达差异分析；微卫星（MSI、STR）和杂和性丢失（LOH）分析；基因或染色体的部分缺失和多倍体的半定量分析等等；该技术可在生殖细胞系和体细胞系中筛查基因变异，它的应用范围包括：癌症基础研究、癌症放疗基因监控、癌症治疗药物基因组学监控、遗传性肿瘤早期诊断、肿瘤表观遗传学研究及诊断、各类遗传疾病的基因诊断、流行病学基因研究、临床微生物基因检测、法医鉴定、动植物遗传育种研究等。
DHPLC原理
DHPLC技术是利用液相色谱技术（HPLC），既在高压闭合液相流路中，将DNA样品自动注入并在缓冲液携带下流过专利的DNA分离柱，通过缓冲液的不同梯度变化，在不同分离柱温度条件下实现对DNA不同的分析；由紫外检测或荧光检测被分离的DNA样品，自动DNA片段收集器可根据需要自动收集被分离后的DNA样品，整个分析过程都是在计算机通过专用软件包NAVIGATOR完成的，
专利的DNA分离柱具有很好的温度稳定性和酸碱稳定性，具有很长的有效寿命（大于6000次进样）和极好的分析稳定性（99%）。
DHPLC DNA色谱分离柱工作原理
DNA分离柱，是使用无孔多苯乙烯-二乙烯基苯（PS-DVB）共聚物微球体作为稳定基质。因为这些微球体都与含有18个碳原子的烷基长碳链相连，所以色谱柱的基质是疏水，电中性的，不会与核酸分子直接发生反应。三乙基铵醋酸盐（TEAA）是一种离子对试剂，离子对试剂既是疏水性的又带正电荷，既能与核酸主链上的磷酸基团的负电荷反应，同时TEAA的疏水基团又与固定相上碳-18链的疏水基团发生反应。这种离子对试剂是连接核酸和柱基质之间的桥梁，因此，它作为“桥分子”使DNA片段吸附在固定相上面。通过改变流动相中乙腈的浓度实现DNA片段的分离。
图1.
分离柱表面的化学反应：TEAA分子与基质的微球体通过疏水键相连，而它的正电荷基团与带负电DNA分子相互作用。
DHPLC工作的三种操作模式：
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工作模式
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温度范围
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应用范围
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分离原理
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非变性
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50℃
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鉴定双链DNA片段长度（小于2000bp）
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按片段长度分离，与序列无关
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PCR产量检查和产物纯化
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定量分析（Q-RT-PCR）
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部分变性
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52-75℃
（平均范围）
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突变检测
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依靠片段大小和序列分离
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单核苷酸多态性（SNP）研究
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完全变性
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75-80℃
（平均范围）
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鉴定单链DNA片段长度（小于2000bp）
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依靠片段大小和序列分离
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RNA分析
（用RNASep柱）
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寡核苷酸分析（DNASep柱与OLIGOSep
柱）和纯化（片段收集器）。大量纯化需用OLIGOSepPrepTM
HC柱
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表1. WAVE核苷酸片段分析系统的三种操作模式，原理及应用领域
非变性条件：依赖分子量大小的分离
WAVEMAKERTM软件能根据DNA片段分子量大小最大限度完善分离条件。在这些条件下，序列顺序并非是决定DNA洗脱方式的因素。系统在50℃运行，碱基对的数量决定洗脱顺序。这种应用在非变性条件下能将染色体插入和缺失片段分开。一般说来，含有1%大小差异的片段能够被分离。例如，100bp的产物能和101bp的产物分开，300bp的产物能和303bp的产物分开。分子量较小的核酸片段含有相应较少的磷酸盐基团结合柱基质，而分子量较大的片段则含有较多的磷酸盐基团结合柱基质。因此，当我们将过柱的乙腈浓度提高，核酸片段就会根据分子量从小到大的顺序被洗脱出来。在不包括柱温度和碱基对序列的影响下，这种柱运行模式已被证明是正确的。对于想用一些已知片段大小的核酸梯度检验其PCR反应的顾客，我们推荐用这种方法。
部分变性条件：根据片段大小，序列和温度的分离
WAVEMAKER软件也能预测突变检测的分析条件。在部分变性的条件下，分离不同成分是根据核酸的大小、序列以及分析温度。以下是变性检测技术原理的阐述，以及它是如何应用的。先设计一对PCR引物，使最大不超过600bp的PCR产物覆盖你所感兴趣的序列。然后将PCR样本移入一块96微孔金属板的孔中，登录WAVE系统分析。在这步后，你就不再需要操作员的进一步帮助。在单核苷酸突变或多态性杂交个体中，野生型DNA和突变型DNA的比率是1：1。加热至95℃，然后慢慢冷却，使PCR产物杂交形成同源双链和异源双链。在分析含有两个等位基因（纯合突变）的DNA时，这种方法需要稍微修改一些。覆盖纯合突变点的PCR产物与野生型扩增DNA混合并杂交。在这步骤后，样本包括异源和同源双螺旋的混合物。
WAVE的分析系统在能足以使DNA异源双链变性（融解）的温度下运行。融解的异源双链在离子对反相液相色谱层析与相应的同源双链分离。这个过程也称为温度调控的异源双链层析或分析。在DNASep柱基质中的精确保留时间使得对单核苷酸多态性（SNP）和短串联重复序列（STRs）的高灵敏、快速检测成为可能。在这里我们应用的一个范例是位于基因座位DYS271上，位点168的核苷酸发生从腺嘌呤到鸟嘌呤的突变。图5显示了运用WAVE系统在一定范围温度变化下四种相应的杂交产物。在用于测定DNA片段大小的非变性条件下（50℃），所有四种杂交产物都有着相同的保留时间。当温度上升到54℃时，异源双链复制物开始在错配碱基两侧区域变性。这种变性导致PCR产物的双链比例减少。在洗脱温度下，单链DNA片段比双链片段更早洗脱。这主要是因为在单链片段分子的负电荷与双链相比较少。因此，异源双链PCR产物比同源双链含有更高的单链的比例，保留时间更短。当同源双链DNA还尚未变性时，异源双链已经被洗脱出来了。在55℃，同源双螺开始变性，野生型腺嘌呤-胸腺嘧啶比突变型胞嘧啶-鸟嘌呤型同源双链变性更快一些。最佳分离温度设为56℃。两种异源双螺旋并没有必要完全分开，因为所感兴趣的样本序列和野生型对照之间的区别表明DNA序列差异的存在。分辨率是依赖于突变位点，片段长度以及序列的具体构象的。
完全变性条件： 根据片段大小和序列的单链分析
单核苷酸和RNA都需要在完全变性的条件下在WAVE系统中分析。在这些洗脱温度下，核酸完全变性，分离是根据片段的大小和序列来实现的。想获得更多完全变性条件的WAVE系统和分析软件的资料，请登录我们的网站www.transgenomic.com.cn
并且阅读我们的应用手册，或者打电话至Transgenomic公司技术支持热线或服务台。
上图完全变性条件下WAVE对标记的寡核苷酸
有很好的分辨率
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